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Luminometría

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Luminometría

Octubre de 2014

Autor: Nicolás Antonio Di Lalla, Lic. en Cs. Químicas (UBA) MN 9833, Responsable de Control de Calidad e Investigación y Desarrollo.

Introducción.

La luminometría es una técnica utilizada para la determinación de un compuesto químico mediante la cuantificación de energía lumínica que el mismo emite en determinadas condiciones. Esta energía generalmente es emitida como luz visible o UV. Existen unas pocas reacciones químicas en las cuales se forman compuestos inestables que tienen exceso de energía en sus orbitales moleculares. Los electrones que forman el enlace pueden espontáneamente decaer a un estado de menor energía (más estable), este proceso va acompañado de la emisión de un fotón por cada electrón involucrado. La frecuencia (ν) y por lo tanto la longitud de onda (λ) del fotón emitido están relacionadas con la diferencia de energía por la constante de Planck (h).

Existe una reacción muy conocida y estudiada entre la luciferina y la enzima luciferasa, la misma no está termodinámicamente favorecida pero en presencia de ATP produce un compuesto que emite luz visible. Esta reacción aparece en la naturaleza, por ejemplo es la causa de la luminosidad de las luciérnagas.

Esta reacción permite una determinación muy precisa de ATP mediante luminometría.
ATP.
El ATP (adenosín trifosfato) es una molécula que está presente en todo tipo de material biológico y es la unidad de energía universal utilizada por las células vivas. El ATP se produce en los procesos metabólicos que tienen lugar en los seres vivos: la fotosíntesis en las plantas, la contracción de los músculos en los animales, la respiración en los hongos y la fermentación de las levaduras.

Las uniones de tipo anhídrido entre los grupos PO4 son de alta energía, el ATP puede hidrolizarse y dar como productos ADP (adenosín difosfato) y fosfato inorgánico PO4 3- (Pi) liberando energía.

Esta energía es la que impulsa reacciones que en principio no serían posibles. Cuando en una célula se producen reacciones que liberan energía, ésta se “guarda” en los enlaces tipo anhídrido del ATP mediante la reacción inversa:

De esta manera, se puede afirmar que el ATP funciona como “dinero” en las células vivas, sirve para llevar a cabo procesos “costosos” y es el modo de ahorrar energía que proviene de procesos “productivos”. Su presencia es universal, desde bacterias hasta células humanas lo utilizan.

Determinación y cuantificación de ATP.

Cuando se quiere comprobar la ausencia de microorganismos, restos de tejido o de células humanas o material de origen biológico en general, puede utilizarse la propiedad del ATP de liberar energía lumínica en presencia de luciferina y luciferasa. La luminosidad resultante, a pesar de ser sumamente baja, puede ser transformada en impulso eléctrico que amplificado puede convertirse en una señal analógica. Esta señal se corresponde con la cantidad de moléculas de ATP detectadas y resulta en un valor de “unidades relativas de luz” que indica la pantalla del equipo.
El instrumento utilizado se denomina Luminómetro, aunque sería más preciso el término ATP-metro.

Determinación y cuantificación de ATP

Descripción del equipamiento para determinar ATP.

La toma de muestra y su preparación son fundamentales a efectos de obtener resultados confiables y precisos. Para esto, generalmente, junto con el equipo se proveen hisopos especiales para el muestreo.

Los mismos son estériles y vienen herméticamente cerrados en un envoltorio; mediante una sencilla maniobra se rompe el compartimento que los protege y quedan en contacto
con una solución en la cual se embebe el extremo que se utilizará para recolectar la muestra. La solución contiene luciferina y luciferasa además de un detergente especial que facilita la penetración del líquido al interior de las células enteras que estén en contacto con el hisopo durante la toma de muestra. Esto es necesario para que el ATP que está en el interior de la célula, ya sea en el citoplasma o en alguna organela, quede disponible y entre en contacto con las sustancias mencionadas. Normalmente el fabricante indica el modo de muestrear superficies y en cuánto
tiempo hacerlo, también cómo introducir el hisopo con la muestra dentro del  instrumento. Por último se acciona algún dispositivo lector de luminosidad generando el dato de RLU’s (unidades relativas de luz) que muestra la pantalla.

Interpretación de resultados.

La esencia de la técnica luminométrica aplicada al ATP es determinar el grado de higiene de una superficie. La presencia de material biológico y, eventualmente, microorganismos resultará en cantidades importantes de ATP que a su vez producirán lecturas elevadas de RLU’s. A bajas concentraciones, existe una correlación lineal entre concentración de ATP y RLU’s, por lo tanto se puede establecer un rango de contaminación (o de limpieza) de la superficie testeada, por ejemplo de la siguiente manera:

La utilización correcta de la técnica puede ser la base de un monitoreo de condiciones higiénicas en un ámbito de elaboración y/o manipulación de alimentos, de producción de medicamentos o de una institución hospitalaria.

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